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El diagnóstico de enfermedades infecciosas ha experimentado una transformación radical en las últimas décadas gracias a la incorporación de métodos moleculares y proteómicos. La identificación y caracterización de agentes infecciosos mediante la detección de su material genético o de sus proteínas permite superar las limitaciones de los métodos tradicionales, como la microscopía, el cultivo y los ensayos inmunológicos, que dependen de la capacidad de crecimiento del microorganismo o de la respuesta inmunitaria del huésped. Los métodos moleculares y proteómicos no solo ofrecen mayor sensibilidad y especificidad, sino que también permiten detectar patógenos difíciles de cultivar, de crecimiento lento o incluso no cultivables.
Los métodos moleculares se basan en la detección de secuencias específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) presentes en microorganismos, lo que permite identificar a los agentes infecciosos incluso en concentraciones muy bajas en las muestras clínicas. Además, estas técnicas pueden distinguir microorganismos estrechamente relacionados, caracterizar variantes genéticas y detectar genes de resistencia a antibióticos, lo que tiene un impacto directo en la selección del tratamiento clínico.
Los métodos moleculares y proteómicos ofrecen varias ventajas:
- Detección directa de microorganismos en muestras clínicas, sin necesidad de cultivo.
- Identificación de agentes no cultivables o de difícil crecimiento.
- Capacidad de detección de múltiples patógenos simultáneamente.
- Cuantificación de cargas virales o bacterianas, útil para seguimiento de tratamiento.
- Identificación de genes de resistencia o factores de virulencia.
- Reducción significativa de los tiempos de diagnóstico, acelerando la intervención clínica.
La combinación de métodos moleculares y proteómicos representa un cambio paradigmático en microbiología clínica, desplazando progresivamente a los métodos tradicionales y estableciendo un estándar de diagnóstico rápido, confiable y altamente sensible. La integración de estas tecnologías continúa expandiéndose, incorporando técnicas de secuenciación masiva y análisis bioinformático, lo que abre la puerta a diagnósticos aún más precisos y personalizados.
Sondas de ácidos nucleicos no amplificadas
Las sondas de ADN o ARN consisten en oligonucleótidos complementarios a secuencias específicas del microorganismo. Sin embargo, cuando se aplican directamente a muestras clínicas, su sensibilidad es limitada, ya que generalmente se requieren grandes cantidades de organismos para una detección confiable. Su uso principal está en la identificación de microorganismos aislados en cultivo, incluyendo bacterias, micobacterias y hongos dimórficos. Estas sondas también pueden detectar secuencias previamente amplificadas mediante técnicas posteriores de amplificación de ácidos nucleicos.
Métodos de amplificación de ácidos nucleicos (NAA)
La revolución diagnóstica moderna se debe principalmente a las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, que permiten multiplicar de manera exponencial fragmentos específicos de ADN o ARN del patógeno, aumentando enormemente la sensibilidad y especificidad del diagnóstico. Estas técnicas permiten identificar agentes que no pueden cultivarse o que se encuentran en cantidades mínimas.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La PCR utiliza una enzima polimerasa resistente al calor y un par de oligonucleótidos específicos llamados cebadores, que se unen a los extremos de la secuencia de ADN objetivo. El proceso se realiza en un termociclador, que alterna entre tres temperaturas: una para separar las hebras de ADN, otra para permitir la unión de los cebadores y otra para la síntesis de nuevas cadenas de ADN. Este ciclo se repite múltiples veces, lo que genera una amplificación exponencial de la secuencia específica.
Variantes de PCR:
- PCR en tiempo real (qPCR): Permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN en la muestra mientras se realiza la amplificación. Es útil, por ejemplo, para medir la carga viral de VIH o citomegalovirus.
- PCR múltiple (multiplex): Detecta simultáneamente múltiples patógenos en una sola reacción, ideal para síndromes clínicos complejos como sepsis o neumonía.
- PCR anidada (nested PCR): Aumenta la sensibilidad y especificidad mediante dos rondas de amplificación consecutivas, reduciendo la probabilidad de falsos negativos.
- PCR con transcriptasa reversa (RT-PCR): Convierte ARN viral, como el de SARS-CoV-2 o virus de influenza, en ADN complementario antes de la amplificación.
Amplificación mediada por transcripción (TMA)
La TMA es una técnica isotérmica diseñada principalmente para ARN. Se utiliza una transcriptasa inversa para generar ADN complementario (cDNA) a partir del ARN del patógeno, que luego se transcribe nuevamente a múltiples copias de ARN mediante una ARN polimerasa dependiente de ARN. Entre sus ventajas se incluyen la rapidez y la eliminación del termociclado, mientras que su limitación principal es la menor eficiencia para objetivos de ADN. Es especialmente útil para la detección de virus de transmisión sexual y virus respiratorios.
Amplificación mediada por bucle (LAMP)
La LAMP es otra técnica isotérmica que utiliza entre cuatro y seis pares de cebadores para amplificar ADN o ARN del microorganismo. Es rápida, eficiente y no requiere equipos complejos de termociclado, lo que la hace ideal para laboratorios con recursos limitados o para diagnóstico en campo. Se ha aplicado con éxito en la detección de Plasmodium spp., Mycobacterium tuberculosis y virus emergentes.
Aplicaciones de los métodos moleculares según el tipo de microorganismo
Virus: Los métodos moleculares permiten detectar virus que no pueden cultivarse fácilmente, como el virus de hepatitis C, VIH, virus respiratorio sincitial y SARS-CoV-2. La PCR y la RT-PCR permiten identificar y cuantificar la carga viral, mientras que la TMA y LAMP ofrecen opciones rápidas y sensibles en entornos clínicos y de vigilancia epidemiológica.
Bacterias: Bacterias de difícil cultivo, como Mycobacterium tuberculosis o Bartonella spp., pueden identificarse mediante PCR o LAMP directamente en muestras clínicas. Además, la detección de genes de resistencia a antibióticos, como mecA en Staphylococcus aureus resistente a meticilina, permite orientar terapias de manera precisa y oportuna.
Hongos: Micobacterias dimórficas y hongos como Candida spp. o Aspergillus spp. pueden detectarse mediante PCR o hibridación de sondas en muestras clínicas o en cultivos. La proteómica basada en espectrometría de masas ha facilitado la identificación rápida de especies fúngicas, superando las limitaciones de los métodos fenotípicos tradicionales.
Parásitos: Parásitos como Plasmodium spp., Giardia lamblia o Toxoplasma gondii se benefician de la detección directa mediante PCR o LAMP. Estos métodos permiten identificar infecciones incluso en fases subclínicas o con baja parasitemia, donde los métodos microscópicos tradicionales podrían fallar.
Métodos proteómicos
Los métodos proteómicos representan un enfoque avanzado y complementario en el diagnóstico de infecciones, centrado en el estudio sistemático del conjunto de proteínas expresadas por un microorganismo en una muestra clínica o en un cultivo. A diferencia de los métodos basados en la detección de ácidos nucleicos, que identifican la presencia del material genético del patógeno, la proteómica ofrece información directa sobre los productos funcionales del genoma, es decir, las proteínas, que son responsables de la estructura, la fisiología y la patogenicidad del organismo. Este enfoque permite no solo confirmar la presencia del agente infeccioso, sino también comprender su comportamiento biológico dentro del huésped.
La espectrometría de masas es la técnica central en la proteómica clínica. A través de esta metodología, las proteínas se fragmentan en péptidos que son analizados según su relación masa-carga, generando patrones altamente específicos que actúan como huellas digitales del microorganismo. Estos perfiles proteómicos son únicos para cada especie y, en muchos casos, incluso para cepas específicas, lo que permite diferenciar patógenos estrechamente relacionados que serían indistinguibles mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, la espectrometría de masas puede distinguir entre especies de Staphylococcus que presentan características fenotípicas similares o diferenciar cepas de Candida con distintas resistencias antifúngicas.
Más allá de la identificación, la proteómica proporciona información sobre el estado funcional del patógeno, incluyendo la expresión de proteínas asociadas a virulencia, resistencia a antibióticos y mecanismos de adaptación al entorno del huésped. Este análisis funcional permite evaluar cómo el microorganismo interactúa con el sistema inmunitario, qué factores contribuyen a su capacidad de causar enfermedad y cómo podría responder a tratamientos específicos. Por ejemplo, la detección de enzimas beta-lactamasas mediante análisis proteómico indica directamente la resistencia de ciertas bacterias a antibióticos beta-lactámicos, información que no puede inferirse únicamente de la secuencia genética.
Otra ventaja de los métodos proteómicos es su capacidad para analizar directamente mezclas complejas de microorganismos en muestras clínicas, como sangre, esputo o fluidos corporales, donde coexisten múltiples especies. Esto permite un diagnóstico más preciso en infecciones polimicrobianas o en situaciones donde la carga del patógeno es baja, superando las limitaciones de métodos de cultivo y ensayos inmunológicos. Asimismo, la proteómica puede integrarse con técnicas de detección de ácidos nucleicos, ofreciendo un enfoque multimodal que combina la sensibilidad de la identificación genética con la información funcional proporcionada por el análisis de proteínas.
Fuente y lecturas recomendadas:
- Madigan, M. T., Martinko, J. M., Bender, K. S., Buckley, D. H., & Stahl, D. A. (2018). Brock biology of microorganisms (15th ed.). Pearson.
- Murray, P. R., Rosenthal, K. S., & Pfaller, M. A. (2025). Medical microbiology (10th ed.). Elsevier.
- Carroll, K. C., & Pfaller, M. A. (2023). Manual of clinical microbiology (13th ed.). American Society for Microbiology Press.
- Riedel, S., Hobden, J. A., Miller, S., Morse, S. A., Mietzner, T. A., Detrick, B., Mitchell, T. G., Sakanari, J. A., Hotez, P., & Mejía, R. (2020). Microbiología médica (28ª ed.). McGraw-Hill Interamericana Editores.
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