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Los métodos diagnósticos moleculares y proteómicos se fundamentan en el análisis directo de las huellas biológicas que dejan los agentes infecciosos en las muestras clínicas. Estas huellas corresponden principalmente a su material genético, como el ácido desoxirribonucleico y el ácido ribonucleico, así como a las proteínas que expresan durante su ciclo biológico. Al igual que ocurre en una investigación forense, la presencia de estas moléculas permite reconocer con precisión al agente causal de una infección, incluso cuando este no puede ser cultivado en el laboratorio o cuando las técnicas inmunológicas convencionales no logran detectarlo.
Una de las principales ventajas de estos enfoques es su alta sensibilidad y especificidad, ya que no dependen de la viabilidad del microorganismo ni de la respuesta inmunitaria del huésped. Las técnicas moleculares, como la secuenciación de ácidos nucleicos, permiten identificar y diferenciar microorganismos a partir de su información genética, mientras que los métodos proteómicos, basados en el análisis detallado de proteínas mediante espectrometría de masas, posibilitan la caracterización de perfiles proteicos únicos de cada patógeno. Gracias a estos avances, procedimientos tradicionales como la microscopía, el cultivo microbiológico y los inmunoensayos están siendo progresivamente desplazados o complementados por estrategias más rápidas, precisas y reproducibles.
Estos métodos abarcan un conjunto amplio de técnicas destinadas a la detección, identificación y caracterización de microorganismos, incluidos virus, bacterias, hongos y parásitos. La detección suele realizarse de manera directa a partir de muestras clínicas, lo que permite un diagnóstico oportuno y una intervención terapéutica temprana. Por su parte, la identificación y caracterización pueden llevarse a cabo tanto en muestras clínicas como en microorganismos previamente aislados en cultivo, proporcionando información detallada sobre su identidad, variabilidad genética, factores de virulencia y, en algunos casos, su resistencia a los tratamientos.
Sondas de ácidos nucleicos no amplificados
Las sondas de ácidos nucleicos no amplificados constituyen una de las aproximaciones más tempranas dentro del diagnóstico molecular. Este método se basa en el uso de fragmentos cortos de ácido desoxirribonucleico o ácido ribonucleico diseñados para unirse de manera específica a secuencias complementarias presentes en el genoma de un microorganismo. La unión entre la sonda y su secuencia diana permite inferir la presencia del agente infeccioso, siempre que la señal generada sea detectable mediante sistemas de marcaje químico, enzimático o fluorescente.
Sin embargo, este enfoque presenta una limitación fundamental: su baja sensibilidad analítica. En la mayoría de las muestras clínicas, la cantidad de material genético del microorganismo es escasa, lo que dificulta una detección fiable sin un paso previo de amplificación. Por esta razón, las sondas no amplificadas rara vez se utilizan para la detección directa de patógenos en muestras clínicas primarias. En cambio, su aplicación resulta más adecuada para la identificación de microorganismos previamente aislados en cultivo, como bacterias, micobacterias y hongos dimórficos, donde la carga microbiana es elevada y suficiente para generar una señal detectable. Además, estas sondas pueden emplearse para confirmar la identidad de secuencias que han sido previamente amplificadas mediante otras técnicas moleculares.
Métodos de amplificación de ácidos nucleicos
Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos han transformado de manera profunda el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Su principal fortaleza radica en la capacidad de incrementar de forma exponencial cantidades mínimas de material genético microbiano hasta niveles fácilmente detectables. Gracias a esta característica, hoy es posible identificar patógenos directamente a partir de muestras clínicas, incluso cuando son difíciles de cultivar o no cultivables mediante métodos tradicionales.
Estas técnicas no solo han acelerado los tiempos diagnósticos, sino que también han ampliado el espectro de microorganismos que pueden detectarse con precisión. En la actualidad, existen ensayos comerciales capaces de identificar simultáneamente múltiples agentes etiológicos asociados a síndromes clínicos complejos, como sepsis, neumonía, gastroenteritis, meningitis y enfermedades de transmisión sexual. Entre la variedad de métodos desarrollados, destacan tres por su uso extendido en los laboratorios clínicos:
- la reacción en cadena de la polimerasa
- la amplificación mediada por transcripción
- la amplificación isotérmica mediada por bucles.
Reacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa es el método de amplificación más ampliamente utilizado en el diagnóstico clínico. Esta técnica emplea una polimerasa de ácido desoxirribonucleico resistente al calor para sintetizar una secuencia específica del genoma microbiano. El proceso requiere un par de cebadores oligonucleotídicos diseñados para unirse a regiones flanqueantes de la secuencia diana, lo que confiere una elevada especificidad al método.
La amplificación se lleva a cabo mediante ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento en un termociclador. Durante estos ciclos, las hebras de ácido desoxirribonucleico se separan, los cebadores se aparean con sus secuencias complementarias y la polimerasa extiende nuevas cadenas. Con cada ciclo, la cantidad de la secuencia diana se incrementa de forma exponencial, permitiendo su detección incluso cuando estaba presente inicialmente en cantidades mínimas.
Existen múltiples variantes de esta técnica. La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa permite amplificar ácidos ribonucleicos tras su conversión en ácido desoxirribonucleico complementario. La reacción en cadena de la polimerasa anidada incrementa la sensibilidad y especificidad mediante dos rondas sucesivas de amplificación. La reacción en cadena de la polimerasa múltiple posibilita la detección simultánea de varios objetivos genéticos, mientras que la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real integra amplificación, detección y cuantificación, lo que resulta esencial para el seguimiento de cargas virales, como en el caso del virus de la inmunodeficiencia humana.
Amplificación mediada por transcripción
La amplificación mediada por transcripción es una técnica isotérmica diseñada principalmente para la amplificación de ácido ribonucleico. En este método, el material genético diana se convierte primero en ácido desoxirribonucleico complementario mediante una transcriptasa inversa. Posteriormente, se generan múltiples copias de ácido ribonucleico a partir de este molde utilizando una polimerasa dependiente de ácido ribonucleico.
Entre sus principales ventajas se encuentran su rapidez, la ausencia de ciclos de calentamiento y enfriamiento, y el hecho de que el producto final sea monocatenario, lo que facilita su detección directa. No obstante, esta técnica presenta un rendimiento limitado cuando se aplica a objetivos de ácido desoxirribonucleico, lo que restringe su uso a determinados contextos diagnósticos.
Amplificación isotérmica mediada por bucles
La amplificación isotérmica mediada por bucles es otro método que opera a temperatura constante y utiliza múltiples pares de cebadores para reconocer distintas regiones de la secuencia diana. Esta estrategia permite una amplificación altamente eficiente de ácido desoxirribonucleico o ácido ribonucleico en un corto periodo de tiempo.
El progreso de la reacción puede monitorizarse en tiempo real mediante la detección de la turbidez generada por un subproducto insoluble de la reacción. Esta característica, junto con la ausencia de instrumentación compleja, hace que este método sea especialmente atractivo para entornos con recursos limitados. Su rapidez, simplicidad y bajo costo lo convierten en una herramienta valiosa para el diagnóstico molecular descentralizado, aunque su diseño requiere un cuidadoso desarrollo de cebadores para garantizar la especificidad.
Análisis de ácidos nucleicos
De manera análoga a cómo las letras, palabras y párrafos permiten comprender el contenido de un libro, las secuencias de ácidos nucleicos presentes en el ácido desoxirribonucleico y el ácido ribonucleico contienen la información necesaria para interpretar las capacidades genéticas de un microorganismo. Estas secuencias permiten conocer desde su identidad básica hasta características complejas relacionadas con su comportamiento biológico, como la virulencia o la resistencia a los antimicrobianos.
En un nivel general, el análisis de una región específica del material genético puede emplearse para identificar un microorganismo a nivel de género o especie, así como para detectar genes que codifican factores de patogenicidad o mecanismos de resistencia a los antibióticos. En un nivel más profundo, el estudio detallado de múltiples regiones genómicas permite diferenciar cepas dentro de una misma especie, lo cual resulta fundamental para fines epidemiológicos, como la investigación de brotes infecciosos. A continuación, se describen las técnicas más utilizadas para la identificación y subtipificación epidemiológica de microorganismos.
Secuenciación de ácidos nucleicos
La secuenciación consiste en determinar el orden exacto de los nucleótidos que componen una molécula de ácido desoxirribonucleico o ácido ribonucleico. Este enfoque puede dividirse en dos grandes estrategias: la secuenciación dirigida y la secuenciación del genoma completo.
La secuenciación dirigida se centra en regiones específicas del genoma y se utiliza principalmente para identificar microorganismos o detectar genes concretos asociados con virulencia o resistencia antimicrobiana. Un ejemplo clásico es la secuenciación de los genes del ácido ribonucleico ribosomal, ampliamente empleada para la identificación definitiva de bacterias y hongos. Algunas regiones de estos genes son altamente conservadas entre diferentes microorganismos, lo que permite su identificación a nivel de género, mientras que otras regiones presentan variaciones específicas que facilitan la discriminación a nivel de especie.
Por otro lado, la secuenciación del genoma completo implica el análisis de la totalidad del material genético de un microorganismo. Esta estrategia se utiliza principalmente para la subtipificación o genotipificación y permite comparar genomas completos entre distintos aislamientos. Durante la replicación bacteriana, pueden introducirse mutaciones puntuales en el genoma, y la acumulación progresiva de estas variaciones refleja el grado de parentesco entre los microorganismos. Cuantas más diferencias genéticas se detectan, menor es la relación entre ellos. Este enfoque se ha convertido en el estándar de referencia para la investigación de brotes infecciosos, ya que permite establecer con gran precisión las cadenas de transmisión.
A pesar de que los avances tecnológicos han reducido de manera significativa los costos y la complejidad técnica de la secuenciación del genoma completo, muchos laboratorios clínicos aún no cuentan con la infraestructura ni la experiencia necesaria para implementar estas herramientas de forma rutinaria. Por ello, continúan utilizándose métodos alternativos para la clasificación epidemiológica.
Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
El análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción es una técnica clásica utilizada para diferenciar cepas específicas de microorganismos, principalmente bacterias y virus. Este método se basa en la acción de enzimas de restricción, las cuales reconocen secuencias específicas del ácido desoxirribonucleico y lo cortan en fragmentos de tamaños definidos.
Debido a las variaciones genéticas entre cepas, el patrón de fragmentos generado tras la digestión del genoma puede diferir entre microorganismos estrechamente relacionados. Estos patrones característicos permiten evaluar el grado de similitud genética y establecer relaciones epidemiológicas entre aislamientos.
Los fragmentos de ácido desoxirribonucleico obtenidos se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. Durante este proceso, los fragmentos migran a través de la matriz del gel a diferentes velocidades, lo que posibilita su separación. Posteriormente, el material genético se visualiza mediante colorantes fluorescentes que se intercalan en el ácido desoxirribonucleico.
Los fragmentos pequeños, como los derivados de plásmidos bacterianos o virus, pueden analizarse mediante electroforesis convencional. En cambio, los fragmentos de gran tamaño, como los provenientes del genoma bacteriano completo, requieren una técnica especializada denominada electroforesis en gel de campo pulsado. En este método, la dirección de la corriente eléctrica se alterna de forma periódica, lo que permite la migración y separación de fragmentos muy grandes que no podrían resolverse con técnicas estándar.
A pesar de su utilidad histórica, este procedimiento es laborioso y ofrece una capacidad de discriminación inferior en comparación con la secuenciación genómica moderna. Por esta razón, es previsible que su uso disminuya progresivamente en los próximos años, a medida que las técnicas de secuenciación se integren de forma más amplia en los laboratorios de microbiología clínica.
Análisis de proteínas
El análisis proteico constituye un pilar fundamental en el diagnóstico microbiológico moderno, ya que las proteínas representan la expresión funcional directa de la información genética de un microorganismo. A diferencia de los ácidos nucleicos, cuyo estudio revela el potencial genético, las proteínas permiten comprender qué genes están siendo expresados y cómo esta expresión se relaciona con la identidad, la patogenicidad y la resistencia antimicrobiana. Entre las técnicas más relevantes para el análisis de proteínas con fines diagnósticos se encuentran:
- el inmunoblot de proteínas.
- la espectrometría de masas asistida por desorción e ionización láser con análisis por tiempo de vuelo.
Además de su papel en la identificación microbiana, esta tecnología ha ampliado recientemente sus aplicaciones hacia la detección de marcadores proteicos asociados con resistencia a antibióticos y factores de virulencia. Asimismo, se han desarrollado protocolos que permiten la identificación directa de ciertos microorganismos a partir de muestras clínicas, reduciendo aún más los tiempos diagnósticos.
Inmunoblot de proteínas (Western blot)
El inmunoblot de proteínas es una técnica diseñada para detectar proteínas microbianas específicas o anticuerpos presentes en el suero del paciente dirigidos contra dichas proteínas. Este método deriva conceptualmente de técnicas previas desarrolladas para el estudio de ácidos nucleicos, adaptadas posteriormente al análisis proteico con fines inmunológicos. Aunque su uso ha disminuido debido al desarrollo de métodos más rápidos y automatizados, continúa siendo una herramienta valiosa en el diagnóstico de ciertas enfermedades infecciosas, como la enfermedad de Lyme, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob mediada por priones y la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana.
En el contexto de la enfermedad de Lyme, el inmunoblot se emplea como prueba confirmatoria tras un resultado positivo inicial obtenido por un inmunoensayo. El procedimiento comienza con la desnaturalización de proteínas microbianas, ya sean purificadas o provenientes de células completas, mediante el uso de agentes reductores y detergentes potentes. Estas proteínas desnaturalizadas se separan según su tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Posteriormente, las proteínas separadas se transfieren desde el gel a una membrana sólida, generalmente de nitrocelulosa o nylon, en un proceso conocido como transferencia o blotting. La membrana se bloquea con proteínas inespecíficas, como las presentes en la leche, para evitar uniones no específicas. A continuación, se incuba con el suero del paciente, permitiendo que los anticuerpos presentes se unan a las proteínas microbianas correspondientes. Tras varios lavados, se añade un anticuerpo secundario conjugado a una enzima, el cual permite visualizar las bandas proteicas reconocidas por los anticuerpos del paciente. El patrón resultante proporciona información diagnóstica basada en la presencia o ausencia de proteínas específicas.
Espectrometría de masas asistida por desorción e ionización láser con análisis por tiempo de vuelo
La introducción de la espectrometría de masas asistida por desorción e ionización láser con análisis por tiempo de vuelo ha representado uno de los cambios más profundos en la historia del diagnóstico microbiológico. Esta tecnología ha sustituido en gran medida a las pruebas bioquímicas y morfológicas que durante más de un siglo constituyeron la base de la identificación microbiana. Su adopción generalizada se debe a su elevada precisión, facilidad técnica, rapidez y bajo costo operativo.
El procedimiento comienza con la toma de colonias bacterianas o de levaduras directamente desde placas de cultivo. Estas se transfieren a una placa metálica específica y se tratan con un ácido orgánico fuerte, como el ácido fórmico, para liberar las proteínas celulares. Posteriormente, la muestra se mezcla con una matriz que absorbe radiación ultravioleta y se deja secar. Al ser expuesta a pulsos láser, la energía es absorbida por la matriz y transferida a las moléculas proteicas, lo que provoca su desorción e ionización sin degradarlas.
Las proteínas ionizadas son aceleradas mediante campos eléctricos a través de un tubo de vuelo dentro del espectrómetro de masas. Durante este trayecto, las moléculas se separan en función de su relación masa-carga, de modo que las proteínas más pequeñas alcanzan el detector más rápidamente que las de mayor tamaño. El resultado es un perfil proteico característico del microorganismo analizado, que se compara con bases de datos de referencia compuestas por perfiles de organismos bien caracterizados. Esta comparación permite identificar microorganismos a nivel de especie o incluso subespecie en cuestión de minutos para bacterias y levaduras, y en menos de una hora para micobacterias y hongos filamentosos.
La selección de la matriz utilizada influye en los biomarcadores detectados, pudiendo enfocarse en proteínas, fosfolípidos o lipopeptidos cíclicos. El ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico se emplea preferentemente para la detección de proteínas. La extraordinaria capacidad discriminatoria de esta técnica se debe a que incluso un cambio mínimo en la secuencia de aminoácidos puede modificar el perfil proteico global.
Fuente y lecturas recomendadas:
- Madigan, M. T., Martinko, J. M., Bender, K. S., Buckley, D. H., & Stahl, D. A. (2018). Brock biology of microorganisms (15th ed.). Pearson.
- Murray, P. R., Rosenthal, K. S., & Pfaller, M. A. (2025). Medical microbiology (10th ed.). Elsevier.
- Carroll, K. C., & Pfaller, M. A. (2023). Manual of clinical microbiology (13th ed.). American Society for Microbiology Press.
- Riedel, S., Hobden, J. A., Miller, S., Morse, S. A., Mietzner, T. A., Detrick, B., Mitchell, T. G., Sakanari, J. A., Hotez, P., & Mejía, R. (2020). Microbiología médica (28ª ed.). McGraw-Hill Interamericana Editores.
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