Técnica de tinción con hematoxilina & eosina
El objetivo de un la histología es comprender la microanatomía de las células, tejidos y órganos y a correlacionar la estructura con la función.
Histología proviene del griego “histos” que significa tejidos; y “logía” que significa estudio o ciencia.
La histología también llamada anatomía microscópica, es el estudio científico de las estructuras microscópicas de los tejidos y órganos del cuerpo. La histología moderna no es sólo una ciencia descriptiva sino que también incluye muchos aspectos de la biología molecular y celular, que ayudan a describir la organización y función celular.
Técnicas de tinción y fijación
El corte de rutina teñido con hematoxilina y eosina es la muestra que se utiliza con mayor frecuencia. La mayor parte de las fotomicrografías utilizadas para ilustrar tejidos y órganos en histología y en conferencias se obtienen de estos preparados. A veces se utilizan otras técnicas de tinción para mostrar componentes específicos de las células y los tejidos.
El primer paso en la preparación de una muestra de tejido u órgano es la fijación para conservar la estructura. La fijación, obtenida en general mediante una sustancia química o una mezcla de sustancias químicas, conserva de forma permanente la estructura del tejido para tratamientos posteriores. Las muestras deben sumergirse en el fijador inmediatamente después de extraerse del organismo. La fijación se utiliza para:
- abolir el metabolismo celular.
- impedir la degradación enzimática de las células y tejidos por la autólisis (autodigestión).
- destruir microorganismos patógenos tales como bacterias, hongos o virus.
- endurecer el tejido como resultado de la formación de enlaces cruzados o de la desnaturalización de moléculas proteicas.
El fijador de uso más común es la formalina, una solución acuosa de formaldehído al 37 %, en diluciones variadas y en combinación con otras sustancias químicas y amortiguadores (buffers).
El formaldehído conserva la estructura general de la célula y de los componentes extracelulares al reaccionar con los grupos amino de las proteínas. Debido a que el formaldehído no altera su estructura tridimensional de forma significativa, las proteínas mantienen su capacidad de reaccionar con anticuerpos específicos. Esta propiedad es importante en las técnicas de inmunohistoquímica. La solución comercial estándar de formaldehído es un mal fijador de las membranas celulares.
Para examinar una muestra se requiere de su infiltración con un medio de inclusión que permita realizar corte muy delgados, por lo general en el rango de 5 µm a 15 µm. Después de la fijación la muestra se lava y se deshidrata en una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente hasta alcanzar alcohol al 100 %. En el paso siguiente, el aclarado, se utilizan solventes orgánicos tales como el xileno o tolueno que son miscibles tanto en alcohol como en parafinas, para extraer el alcohol antes de la infiltración de la muestra con la parafina fundida.
Cuando la parafina fundida se ha enfriado y endurecido, se empareja para formar un bloque de tamaño adecuado. Este bloque se coloca en una máquina cortadora especial, el micrótomo que lo corta en rebanadas finas con una cuchilla de acero. Los cortes obtenidos se montan sobre portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje (pineno o resinas de acrílico) como adhesivo.
Debido a que los cortes histológicos en parafina son incoloros se deben teñir y la parafina debe disolverse y extraerse, con xileno o tolueno y los tejidos deben rehidratarse mediante el uso de una serie de soluciones de alcohol de concentración decreciente. Después, el tejido sobre el portaobjetos se tiñe con hematoxilina en agua. Debido a que el colorante de contraste, la eosina, es más soluble en alcohol que en agua, se vuelve a deshidratar la muestra a través de una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente y después se tiñe con eosina en alcohol.
Después de la tinción, la muestra se pasa por xileno o tolueno y se le coloca un medio de montaje no acuoso antes de cubrirla con un cubreobjetos para obtener un preparado permanente.
Los corte teñidos con H&E de muestras fijadas en formalina muestran adecuadamente las características estructurales generales pero no son específicos para dilucidar la composición química de los elementos celulares. Muchos componentes se pierden durante la preparación de la muestra. Para retener estos componentes y estructuras, se deben utilizar otras técnicas de fijación.
Para conservar los lípidos neutros, como los de las células adiposas, se deben utilizar cortes por congelación de tejido fijado en formalina y colorantes que se disuelvan en grasa; para conservar las estructuras de la membrana, se utilizan fijadores especiales con metales pesados, como permanganato y osmio, que se unan a los fosfolípidos. El empleo de rutina de tetróxido de osmio como fijador en la microscopia electrónica es la razón principal del excelente estado de conservación de las membranas en las fotomicrografías electrónicas.
El uso de orceína y fucsina- resorcina es específico para el material elástico y la impregnación argéntica para fibras reticulares y las membranas basales.
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